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Die Schwierigkeit der klinischen Diagnostik (Gelesen: 1975 mal)
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Langelsheim, Niedersachsen, Germany
Zeige den Link zu diesem Beitrag Die Schwierigkeit der klinischen Diagnostik
11. September 2007 um 23:12
 
http://www.diss.fu-berlin.de/diss/servlets/MCRFileNodeServlet/FUDISS_derivate_00...

Das Ziel dieser klinisch-diagnostischen Studie war es, herauszufinden, ob die derzeitigePraxis des indirekten Erregernachweises für die Diagnosestellung Lyme-Borreliose (LB)beim Pferd hilfreich ist und welche Rolle dem direkten Erregernachweis in der Routinediagnostik der LB zufällt. Für dieses Vorhaben war eine interdisziplinäre Zusammenarbeit mit dem Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin (BgVV, Berlin)*, dem Bayerischen Landesamt für Gesundheit undLebensmittelsicherheit (LGL, Oberschleißheim) und dem Analytischen Labor ALOMED(Radolfzell-Böhringen) erforderlich.

Die Schwierigkeit der klinischen Diagnostik einer LB in Europa beruht vor allem auf demFehlen eines definierten Krankheitsbildes und dem unterschiedlichen Erregerspektrum. Die aus Amerika stammenden Fallbeispiele sind allein durch B. burgdorferi s.s. verursacht und immer mit deutlicher Symptomatik verbunden. Hingegen zeigt sich das Erregerspektrum in Europa sehr vielfältig. Mittlerweile sind 13 Genospezies von B. burgdorferi s.l. in Europabekannt, wovon mindestens drei einen pathogenen Charakter besitzen: B. burgdorferi s.s. istmeist mit Arthritis und Synovitis (Lyme-Arthritis), B. garinii mit der sogenanntenNeuroborreliose und B. afzelii mit Hautmanifestationen assoziiert (VAN DAM et al., 1993; BALMELLIand PIFFARETTI, 1995; OSCHMANNet al., 1999; CUTLERand WOODWARD, 2001;BERGSTRÖMet al., 2002). Da Zecken, die potentiellen Überträger von B. burgdorferi s.l., meist nicht nur eine Borrelienart, sondern häufig verschiedene Spezies beherbergen, ist eineMehrfachinfektion im Wirtsorganismus möglich (KLAPPER, 1999; LEUTENEGGERet al., 1999;PICHONet al., 1999; LAYFIELDand GUILFOILE, 2002). Daraus resultiert eine große Varianz von potentiellen Krankheitsbildern, die eine Diagnosestellung und damit die therapeutischenMaßnahmen massiv erschweren.

Hinzu kommt, dass in Europa nur wenige apparente LB-Infektionen beobachtet wurden. Bei einer seroepidemiologischen Studie in England registrierten BROWNINGund Mitarbeiter(1993) einen Fall von Lahmheit beim Pferd, bei dem aufgrund der Anamnese, der klinischen Zeichen und der erfolgreichen antibiotischen Therapie die Verdachtsdiagnose LB gestelltwerden konnte. Allerdings erfolgte keine Verifizierung der Diagnose mit Hilfe des direktenErregernachweises. *seit dem 01.11.2002 Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR)
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DiskussionKapitel 592HAHN und Mitarbeiter berichteten 1996 erstmals detailliert über einen Borreliose-Fall in Großbritannien. Es handelte sich um eine 8jährige Vollblutstute, die seit 3 Wochen unterLethargie, Anorexie, Fieber, Ataxie und Hyperästhesie am Kopf litt. Nach anfänglichemBehandlungserfolg mit Antibiotika verschlechterte sich ihr Zustand zusehends. Zu denbeobachteten Symptomen zählten: Arthritis vor allem der Karpalgelenke, intermittierendesFieber, Bewegungsunlust, Füllung der Sehnenscheiden, akute Uveitis, Hypersensitivität amKopf, an den Beckengliedmaßen und in der Perinealregion, bis hin zu Depression,Kopfpressen, Stupor, Manegebewegungen, quadripedaler Ataxie und extremer Exzitation.Die Untersuchung der im Abstand von 2 und 4 Wochen gewonnenen Serumproben auf AKgegen B. burgdorferi s.l. mit Hilfe des ELISA war erfolgreich.

Eine Isolierung von Borrelien-DNA gelang mit Ausnahme des Augenkammerwassers aus dem gesamten Probenmaterial.Ein Nachweis von mobilen Spirochäten konnte mittels Dunkelfeldmikroskopie geführtwerden, der jedoch aufgrund von Kontamination nicht reproduzierbar war. In diesem Fall wurde erstmals eine LB-Erkrankung beim Pferd anhand der Symptomatik und derlabordiagnostischen Untersuchungen mit Hilfe der PCR sowie des ELISA sicherdiagnostiziert. LIEBISCHund Mitarbeiter beschrieben 1999 die ersten LB-Verdachtsfälle bei Pferden inDeutschland. Dabei bezogen sie sich auf vier der beobachteten sechs Fälle. Die registriertenklinischen Zeichen waren vorrangig Polyarthritis, Endokarditis, Kachexie, beidseitigechronische Keratitis, diffuse Hyperkeratose und sarkoide Hautveränderungen. Der Nachweis von AK gegen B. burgdorferi s.l. erfolgte mit Hilfe des IFT (Titerstufen von 1:128 bis 1:1024)und wurde durch den Western Blot bestätigt. Die kulturelle Anzüchtung vonB. burgdorferi s.l. aus der Haut, der Synovia sowie der nach der Euthanasie entnommenenGewebeproben (Lymphknoten, Lunge, Niere, Leber, Großhirn u.a.) gelang teilweise schon nach 24 Stunden.

Diese erste Fallbeschreibung aus Deutschland wird jedoch kontrovers diskutiert, da keinem der akkreditierten Laboratorien jemals eine Kultivierung von Borrelien indieser kurzen Zeit gelang. Die Verfasser berichteten außerdem, dass aus den zahlreich angegebenen Isolaten ohne Schwierigkeit Reinkulturen von B. burgdorferi s.l. angezüchtetwerden konnten, wobei konkrete Angaben fehlten. Auch spätere Veröffentlichungenenthielten keine detaillierten Angaben zu den Ergebnissen (Liebisch et al., 2002).Erwähnung fand nur ein Isolat aus einer Milzprobe, das durch Sequenzanalyse mit B. afzeliiidentisch war und nach intraperitonealer Injektion aus Gelenkmaterial der Maus reisoliertwerden konnte. Diese Darstellung erfolgte auf der Lyme-Borreliose Konferenz in New York(2002) und wurde von den anwesenden internationalen Experten aus o.g. Gründen sehrkritisch betrachtet (persönliche Mitteilung von SCHÖNBERG, 2002).
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Diskussion
Kapitel 593

Weitere Fallbeispiele wurden bis zum heutigen Zeitpunkt nicht beschrieben.Epidemiologischen Untersuchungen zufolge konnte kein signifikanter Zusammenhangzwischen Seropositivität und Symptomatik im Sinne einer Lyme-Borreliose bei Pferdenregistriert werden (KÄSBOHRERund SCHÖNBERG, 1990; CARTERet al., 1994; GERHARDSund WOLLANKE, 1996; VENNERund DEEGEN, 1996). Eine neue Studie aus Schweden zeigte jedoch eine Assoziation zwischen positivem AK-Nachweis und Gelenkserkrankungen auf(EGENVALLet al., 2001).Die hier vorgestellten Fallbeispiele lassen die Vielzahl der möglichen Symptome einer LB beim Pferd erkennen. Viele dieser klinischen Zeichen können auch auf andere Erkrankungenzurückgeführt werden. Das Fehlen eines pathognomonischen Befundes in der klinischen sowie labordiagnostischen Beurteilung eines LB-Verdachtes erschwert daher die Stellung einer Kausaldiagnose.5.1.Eignung der Probanden und des Untersuchungsmaterials Die Probanden wurden aus dem Patientengut der Klinik für Pferdekrankheiten, AllgemeineChirurgie und Radiologie der Freien Universität Berlin rekrutiert (n=337). Eine Auswahl derProbanden aus dem Patientenpool der Pferdeklinik erfolgte nicht, da alle Tiere, die innerhalb eines Zeitraumes von 10 Monaten in der Klinik vorstellig wurden, auf eine B. burgdorferi s.l.-Infektion hin untersucht worden sind. Die Pferde stammten ausschließlich aus Berlin/Brandenburg und standen somit für eine regional begrenzte epidemiologische Studiezum Vorkommen von B. burgdorferi s.l. zur Verfügung.

Jedes Tier wurde einer vollständigen klinischen Untersuchung nach propädeutischenKriterien mit anschließender Blutprobenentnahme unterzogen. Nach der klinischenUntersuchung erfolgte die Einteilung der Probanden anhand ihrer Symptomatik in dieGruppen A und B. Die Gruppe A beinhaltete die Tiere ohne klinische Zeichen einer LB(n=195). Die Pferde aus der Gruppe B zeigten hingegen LB-ähnliche Symptome (n=142).Diese Einteilung erfolgte unabhängig von der im Anschluss an die klinische Untersuchunggestellten Diagnose, da ein einheitliches Krankheitsbild LB beim Pferd in Europa bis heutenicht existiert. So wurde in Anlehnung an die wenigen Fallbeispiele aus der europäischenLiteratur eine Auswahl von potentiellen Symptomen getroffen und für die Gruppenbildungverwendet (HAHNet al., 1996; LIEBISCHet al., 1999). Die vielfältigen sowie individuell und regional abhängig beurteilten klinischen Zeichen umfassten viele Organsysteme undüberschnitten sich daher auch mit anderen Krankheitsbildern. Somit war eine begründete
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Diskussion
Kapitel 594
klinische Verdachtsdiagnose „LB beim Pferd“ in dieser Studie nicht möglich. Die Beurteilungder Probanden hinsichtlich ihrer Symptomatik und der daraus folgenden Einteilung in die Gruppen A und B gestaltete sich durch die Vielzahl der möglichen LB-Symptome als sehrschwierig. Deshalb wurden die für jeden Patienten individuell erhobenen Befunde demjeweilig erkrankten Organsystem zugeordnet, um so eine statistisch erfassbare Aussage zuden potentiellen Krankheitsbildern zu erhalten. Bei einigen klinisch auffälligen Pferden im Sinne eines LB-Verdachts konnte zusätzlich zur Blutprobe weiteres Probenmaterial (Haut, Liquor, Synovia und Vollblut) für den direktenErregernachweis gewonnen werden. Damit erfolgte der Versuch einer Verifizierung derVerdachtsdiagnose LB, der jedoch bei keinem der verdächtigen Fällen eindeutig gelang. Aufdie Ursache des Versagens eines reproduzierbaren Nachweises von B. burgdorferi s.l. wird später eingegangen. Die von jedem Pferd entnommene Blutprobe wurde innerhalb der nächsten 30 minzentrifugiert und bei -21 ± 3°C bis zur Untersuchung asserviert. Innerhalb dieser Zeit erfolgteauch das Anfertigen des Differentialblutbildes, da es nach 1 Stunde Lagerung von EDTA-Blutzur Lyse von Mono- sowie Granulozyten und somit zur Verfälschung des Blutausstricheskommen kann (THOMAS, 1992; TAYLOR and HILLYER, 2001). Vom Probenmaterial Haut, Liquor, Synovia und Vollblut der klinisch auffälligen Patientenwurden innerhalb der nächsten 15 min Aliquots entnommen, davon eines kultiviert und das andere bei -21 ± 3°C bis zur Untersuchung gelagert. Nach GRABNER (persönliche Mitteilung,2000) sowie THOMAS(1992) ist die Lagerung von Körperflüssigkeiten bei -21 ± 3°C für dieErhaltung der Spezifität von darin enthaltenen Antigenen sowie Antikörpern ausreichend.Die Auswahl sowie die Bearbeitung des Probenmaterials erfolgte nach den aktuellen Vorschriften aus der Literatur (SCHÖNBERGet al., 1988; CHANGet al., 1999; PRIEMund KRAUSE, 1999; HEIDRICH, 2000; WILSKEet al., 2000). 5.2.Bewertung der Ergebnisse der labordiagnostischen Untersuchung Direkter Erregernachweis Ein Nachweis von B. burgdorferi s.l.-DNA gelang mit Hilfe der nested-PCR in 12 der 76Proben. Allerdings konnte die LightCycler-PCR, durchgeführt vom Labor ALOMED, dieses Ergebnis nicht bestätigen.
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Diskussion
Kapitel 595

Die nested-PCR und die LightCycler-PCR sind aufgrund der unterschiedlichen Primerwahlund der damit verbundenen Spezifität sowie Sensitivität nicht direkt miteinander vergleichbar.Die nested-PCR zeichnete sich durch zwei aufeinanderfolgende Durchläufe mitunterschiedlichen Ansätzen aus (äußerer und innerer Ansatz) und wurde zur Detektion desB. burgdorferi s.l.-spezifischen Amplikon 392 bp verwendet. Bei der LightCycler-PCR handelte es sich um eine real-time Fluoreszenz-Detektion des B. burgdorferi s.l.-spezifischenAmplikons (260 bp). Dieser Sachverhalt verdeutlicht die Schwierigkeit in der Beurteilung von Spezifität und Sensitivität der PCR. Die in der Literatur beschriebenen Methoden zur Primerauswahl, Extraktionstechnik sowie Reaktionsbedingungen variieren außerordentlich. Gleichzeitigexistieren keine Vergleichsstudien. Hinzu kommt, dass wenige Laboratorien in der Lage sind,in ausreichender Qualität und Reproduzierbarkeit die Nukleinsäure-Amplifikations-Technikendurchzuführen (WILSKEet al., 2000).Diese Fakten offenbaren, dass ohne eine Standardisierung der PCR-Methode eine vergleichende Bewertung des Probenmaterials nicht realisiert werden kann. Deshalb ist esdringend erforderlich, eine Vereinheitlichung der Primer und des PCR-Protokolls zu erreichen. Unabhängig von dem Vorhandensein von Borrelien beweist ein positives PCR-Ergebnis nicht, ob es sich um intakte und somit vermehrungsfähige Erreger handelt. Diese können nurdurch die kulturelle Anzüchtung nachgewiesen werden. In dieser Arbeit wurde jedoch keinBorrelienwachstum in den Kulturen beobachtet. Ein Wachstum des Kontrollstammes war jedoch nachweisbar, was für die Funktionalität des Kultursystems spricht.Die Anzüchtung von Spirochäten verlangt aufgrund ihrer langen Generationszeit von 10-20Stunden im Vergleich zu anderen Bakterien und der hohen Ansprüche an dieZusammensetzung und Qualität der Kulturmedien besondere Sorgfalt. Dies trifft auch für B. burgdorferi s.l. zu und wurde bei der Auswahl und Präparation der verwendeten Medienentsprechend berücksichtigt. Das BSK-Medium gilt als das Standard-Medium für dieAnzüchtung von Borrelien und wurde im LB-Labor des BgVV*mit Erfolg für die Isolierungverschiedener Spezies von B. burgdorferi s.l. sowohl aus Zecken als auch aus Hautprobendes Menschen eingesetzt (SCHÖNBERG et al., 1988; OTT und SCHÖNBERG, 1988; SCHÖNBERG et al., 1995; GUPTA et al., 1995; GRAY et al., 1996; KAHL et al., 1998). *seit dem 01.11.2002 Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR)
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Diskussion
Kapitel 596

Das Wachstum des Kontrollstammes B. garinii, Stamm 1B29 (SCHÖNBERGet al., 1988)bestätigt die Leistungsfähigkeit der hergestellten Medien, die im Rahmen der Akkreditierungnach den in der Laborarbeitsanweisung „5-LA 169“ des BgVV enthaltenen Vorschriften vorihrer Verwendung erfolgreich geprüft wurden. Als Ergänzung wurde auch das MKP-Medium zur kulturellen Anzüchtung von Borrelien aus dem Probenmaterial verwendet. Mit diesem konnte das Referenzlabor für LB des Menschen (Pettenkofer-Institut, München) verschiedene Spezies von B. burgdorferi s.l. aus Haut, Liquorund Blut isolieren. Wenn auch in neueren Studien durch Zugabe von EMEM (engl. Eagle’sMinimum Essential Medium) zum BSK-Medium im Verhältnis von 1:1 höhere Isolationsratenvon B. burgdorferi s.l. aus Zecken (SPECK et al., 2002) erzielt wurden, so ist es wichtig, darauf hinzuweisen, dass der Nachweis von Borrelien aus Zeckenhomogenat sichwesentlich einfacher gestaltet. Für die Beantwortung der Frage, warum die Isolierung von B. burgdorferi s.l. trotz Verwendung von optimalen Nährmedien nicht gelang, müssen verschiedene Gründediskutiert werden. Einen großen Einfluss hat die vorhandene Keimzahl der Borrelien in derProbe, wobei der Anzuchterfolg durch anwesende Begleitkeime, deren Generationszeitweniger als 1 Stunde beträgt, erschwert wird. Um die Kontaminationen gering zu halten,wurden mit Erfolg Hemmstoffe eingesetzt und Subkulturen angelegt. Neben der Keimzahl der Borrelien ist auch der Anteil an lebenden Zellen und damit ihre Vermehrungsfähigkeitvon großer Bedeutung. Je kürzer die Zeitspanne zwischen Probenentnahme und Anlegender Kulturen ist, um so erfolgreicher gestaltet sich die kulturelle Anzüchtung. So wurden indieser Arbeit die Kulturen 15 Minuten nach Probenentnahme angelegt und bei 33°Cbebrütet. Nach 24 Stunden erfolgte eine Subkultivierung. Diese Vorgehensart stellt eine optimale Voraussetzung für die kulturelle Anzüchtung des Erregers dar, die unterPraxisbedingungen nicht realisierbar ist. Ein weiterer Diskussionspunkt ist die Auswahl des Untersuchungsmaterials für den direktenErregernachweis. Die Wahl der Biopsie- sowie der Punktionsstelle erfolgte in Abhängigkeitvon der Lokalisation der Erkrankung. So wurde ein gefülltes Gelenk, das die Lahmheitverursachte, punktiert. Für die Diagnostik von neurologischen Erkrankungen war esnaheliegend, eine Liquorpunktion im Spatium atlantooccipitale durchzuführen. Falls derVerursacher des Krankheitsbildes sich als B. burgdorferi s.l. herausstellte, wäre die Wahrscheinlichkeit seiner Anwesenheit im Liquor (immunologische Nische) relativ groß. Bei Hautveränderungen erfolgte die Biopsie am Übergang vom gesunden zum verändertenGewebe. Hautproben können bei korrekter Aufbereitung ohne Schwierigkeiten kultiviert werden
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Diskussion
Kapitel 597

In der Humanmedizin finden sie vorrangig für den Nachweis von B. burgdorferi s.l.bei dermatologischen Krankheitsbildern Anwendung (MANIONet al., 1998; TALASKA, 1998a;CHANGet al., 1999; PRIEMund KRAUSE, 1999). Liquor und Synovia eignen sich ebenfalls gutfür die kulturelle Anzüchtung, obwohl Borrelien aus Körperflüssigkeiten schlechternachweisbar sind als aus Gewebeproben. Diese Regel gilt auch für den Nachweis vonBorrelien-DNA mit Hilfe der PCR. Mit Hautbioptaten und Liquor zeigte die PCR einediagnostische Sensitivität von ca. 60% bzw. 25%. Bei Synoviaproben wurde sogar eineSensitivität zwischen 50-70% erreicht (WILSKEet al., 2000). Die Auswahl des Untersuchungsmaterials richtete sich somit nach den Anforderungen der MiQ 12/2000 – Qualitätsstandards in der mikrobiologisch-infektiologischen Diagnostik (WILSKEet al., 2000). Nach unseren negativen kulturellen Ergebnissen ist es sehr erstaunlich, dass LIEBISCHund Mitarbeiter (1999) über eine Anzüchtung von B. burgdorferi s.l. aus der Haut des Pferdesberichten, die schon nach einer Inkubationszeit von 1-2 Tagen zum Erfolg führte. Einerpersönlichen Mitteilung (LIEBISCH, 2001) zufolge wurde dabei nur BSK-Medium eingesetzt.Auch nach 5 Jahren ist aus dem umfangreichen internationalen Schrifttum kein Autorbekannt, der aus Proben von Tieren oder vom Menschen über eine Anzucht von B. burgdorferi s.l. nach dieser sehr kurzen Inkubationszeit berichtet. Daneben ist es wichtig,darauf hinzuweisen, dass die unbeweglichen spirochätenähnlichen Gebilde, die nach einerkurzen Inkubationszeit von 2 Tagen auftreten und durch Flagellen der Begleitkeimeentstehen, irrtümlicherweise für Borrelien gehalten werden können (HEIDRICHet al., 1999).Bei den unbeweglichen spirochätenähnlichen Gebilden, die in einem Fall der vorliegendenUntersuchung auftraten, handelt es sich danach höchstwahrscheinlich auch um Flagellen derbeweglichen Begleitkeime (s. Abb. 14). Abschließend ist die Frage nach dem Vorhandensein von Borrelien in den Proben derLB-verdächtigen Pferde nicht zu beantworten, da eine kulturelle Anzüchtung in keinem derFälle gelungen war und das positive Ergebnis in der nested-PCR mit Hilfe der Real-time-PCR nicht bestätigt wurde. Bei der vergleichenden Betrachtung der beiden Methoden des direkten Erregernachweisesist zu beachten, dass ein positives PCR-Ergebnis eine LB weder ausschließen nochbeweisen kann. Es ermöglicht lediglich einen Rückschluss auf das Vorhandensein desErregers. Ob dieser noch infektionsfähig oder bereits abgetötet ist, wird mit dem Verfahrennicht beantwortet. Die PCR sollte daher nur im Kontext anderer Nachweisverfahren und desklinischen Bildes durchgeführt werden (TALASKA, 1998a; PRIEMund KRAUSE, 1999).
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Diskussion
Kapitel 598

Einen eindeutigen Beweis für das Vorhandensein infektionsfähiger Borrelien liefert nur diekulturelle Anzüchtung, die sich aufgrund ihrer Ansprüche an die Kulturmedien sowie an die Inkubationsbedingungen jedoch schwierig gestaltet. Deshalb sollte der kulturelle Erregernachweis auf spezielle Indikationen, z.B. der Abklärung klinisch und serologisch nichteindeutiger Befunde, beschränkt werden (WILSKEet al., 2000). Indirekter Erregernachweis In der Gruppe A (Probanden ohne Symptomatik einer LB) wurden in den 3 verwendetenELISA (s. Kap. 4.2.2.1. und 4.2.2.2.) folgende positive Antikörpertiter bestimmt A: 61,5%,B: 9,7%, C: 2,6%. Unter den LB-verdächtigen Pferden (Gruppe B) reagierten im ELISAA: 60,6%, B: 9,9%, C: 4,2% seropositiv. Somit kann im ELISA A eine Abnahme derseropositiven Reagenten in der borrelioseverdächtigen Gruppe registriert werden. Hingegenlassen ELISA B und C eine Zunahme der AK-positiven Pferde in Gruppe B erkennen. Beide Aussagen sind nicht signifikant und eher zufällig. Bei der ver
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